Delavnica: Gradnja

Delavnica: Gradnja#

Namen#

Namen delavnice je spoznati osnove ročne gradnje in piljenja modela strukture proteina z uporabo eksperimentalnih podatkov. V tem primeru gre za elektronsko gostoto, izračunano iz difrakcijskih podatkov (makromolekulska X-žarkovna kristalografija), podobni principi pa veljajo tudi v primeru elektronske difrakcije in krio-elektronske mikroskopije.

Potrebščine#

Za izvedbo potrebujete:

  • spletni brskalnik (najbolje na namiznem ali prenosnem računalniku, pogojno na tablici, na slednji je sicer malce težje manipulirati z modeli struktur; mobilni telefon ni primeren),

  • povezavo v splet.

Miška

Priporočam uporabo miške, ki omogoča levi in desni klik ter kolešček (sredinski klik), saj to bistveno olajša manipulacijo struktur v 3D.

Kratka navodila#

Pri delu bomo uporabljali program Moorhen, ki predstavlja spletno različico programa COOT (Crystallographic Object-Oriented Toolkit), danes najpogosteje uporabljanega programa za gradnjo, piljenje in validacijo modelov struktur makromolekul [Emsley et al., 2010]. Isti program se lahko uporablja tako za gradnjo modelov struktur na osnovi podatkov, pridobljenih z difrakcijo, kot tudi s krio-elektronsko mikroskopijo.

Začetni podatki#

Za demonstracijo gradnje in piljenja modela bomo uporabili skoraj popolnoma zgrajen in izpiljen model strukuture človeškega estrogenskemu receptorju podobnega receptorja gama (ESRRG, UniProt P62508).

Aminokislinsko zaporedje kristaliziranega konstrukta je podano spodaj:

LGSPEFLNPQLVQPAKKPYNKIVSHLLVAEPEKIYAMPDPTVPDSDIKAL
TTLCDLADRELVVIIGWAKHIPGFSTLSLADQMSLLQSAWMEILILGVVY
RSLSFEDELVYADDYIMDEDQSKLAGLLDLNNAILQLVKKYKSMKLEKEE
FVTLKAIALANSDSMHIEDVEAVQKLQDVLHEALQDYEAGQHMEDPRRAG
KMLMTLPLLRQTSTKAVQHFYNIKLEGKVPMHKLFLEMLEAKVC

N-končni del zaporedja LGSPEF in C-končni ostanek C niso del zaporedja v UniProt, tako da le regija L220–V458 ustreza zaporedju pod zgoraj omenjenim UniProt zapisom.

Drugi relevantni podatki:

  • kristalizacijski pufer: 0,05 M HEPES, 0,75 M natrijev citrat, 5 % glicerol, pH 7,5

  • kokristalizacija z bisfenolom A

  • ločljivost: 1,6 Å

  • prostorska skupina: P 41 21 2 (tetragonalna), 8 asimetričnih enot na osnovno celico

Povezavi za prenos datotek, potrebnih za delo:

Gradnja in piljenje modela#

Nalaganje podatkov#

  1. Običite stran moorhen.org. Program je še v razvoju, zato se lahko delovanje v nekem časovnem obdobju spremeni.

  2. Naložite podatke:

    • model strukture: Menu > File > Coordinates > Choose Files > esrrg_1p6_ref.pdb

    • strukturne faktorje ter karte elektronske gostote: Menu > File > Auto open MTZ… > esrrg_1p6_ref.mtz > OK

  3. Povežite model strukture s strukturnimi faktorji in s tem omogočite osveževanje karte elektronske gostote v realnem času ter izračun faktorja R: Menu > File > Connect mol. and map for updating… > (preverite nastavitve) > OK

  4. Razglejte se – identificirajte kanale topila in preverite “neskončnost” karte elektronske gostote.

  5. Primerjajte običajno (2mFo–Fc, modre barve) ter diferečno (mFo-Fc, zelene in rdeče barve) karto elektronske gostote. Kaj nam kažeta?

Pozor! Ko enkrat naložite podatke pazite, da ne osvežite strani ali zaprete brskalnika!

Moorhen z naloženim modelom strukture in kartami elektronske gostote

Hitri tečaj za Moorhen#

  • vrtenje pogleda: pritisnite in držite levi miškin gumb ter vlevite v levo/desno/bavzgor/navzdol

  • premikanje: pritisnite in držite sredinski miškin gumb ter vlevite v levo/desno/bavzgor/navzdol

  • centriranje pogleda na nek atom: kliknite na atom s sredinskim miškinim gumbom

  • odprite hitri meni za piljenje: kliknite na desni miškin gumn

  • približevanje/oddaljevanje pogleda: miškin kolešček

  • sprememba nivoja kontutiranja karte elektronske gostote: CTRL + miškin kolešček (pazite, katera karta je izbrana kot aktivna)

Gradnja in piljenje modela strukture#

Model strukture ESRRG je skoraj dokončno zgrajen, kljub temu pa prisotnih nekaj napak in pomankljivosti, med drugim:

  • nekateri deli so popolnoma napačno postavljeni (niso v skladu z eksperimentalnimi podatki),

  • nekateri ostanki imajo dihedralne kote glavne verige izven dovoljenih območij,

  • končni del verige ni zgrajen,

  • nekateri ostanki bi morali imeti alternativno konformacijo,

  • manjkajo ligandi,

  • manjkajo molekule vode.

Nekaj namigov, kaj popraviti:

  • Oglejte si ostanek Y315. Kaj je potrebno tu popraviti? (Glejte namig 1.)

    • Za premikanje po zaporedju kliknite Menu > Models > Sequences ali pa pritisnite “SHIFT + g” in vnesite zaporedno številko ostanka.

  • Oglejte si ostanek N235. Se vam zdi v redu glede na elektronsko gostoto in kemijsko okolje? (Glejte namig 2.)

  • Oglejte si regijo V325–A327. (Glejte namig 3.)

  • Oglejte si S428. Kaj manjka? (Glejte namig 4.)

  • Oglejte si C-končni del. Bi lahko zgradili še kakšen del polipeptidne verige? (Glejte namig 5.)

  • Analizirajte nezmodelirane “balončke” (blobs; Menu > Validation > Unmodelled blobs…). Prvi na seznamu je največji. Kaj bi lahko sem umestili? Poglejte, s čim je bil protein kristaliziran in kaj je bilo v pufru.

    • Ligand lahko dodate tako: Menu > Ligand > Get monomer… > vnesite Ligand Expo ID.

      • Po dodatku liganda je potrebno izpiliti ujemanje z elektronsko gostoto.

    • Druga možnost je avtomatsko iskanje liganda preko Menu > Ligand > Find ligand…, pri čemer pa moramo ligand že imeti naložen nekje v prostoru.

Med gradnjo opazujte spreminjanje diferenčne karte elektronske gostote ter vrednosti faktorja R.

Namigi za gradnjo:

  1. Izberite drug rotamer, nato pa naredite še piljenje v realnem prostoru (real space refinement), včasih zadostuje zgolj piljenje v realnem prostoru.

  2. Stransko skupino je potrebno obrniti za 180°. Kaj s tem dosežemo v smislu interakcij s sosednjimi skupinami?

  3. Popraviti je potrebno položaj daljšega odseka, izberite vsaj regijo V325–A327. Za izbiro regije držite SHIFT in enkrat kliknite na katerikoli atom prvega ostanka v željenem odseku, nato pa še na katerikoli atom zadnjega. Popravek naredite tako, da najprej malce ročno povlečete regijo v elektronsko gostoto, na koncu pa naredite še piljenje v realnem prostoru.

  4. Ta ostanek ima alternativno konformacijo. Dodajte jo, zanjo izberite drug konformer, ter zaključite s piljenjem v realnem prostoru.

  5. Seveda, preverite aminokislinsko zaporedje kristaliziranega konstrukta in jih dodajte toliko, kolikor jih lahko glede na elektronsko gostoto ter jih lepo umestite vanjo. Lahko zgradite popolnoma ves C-konec?

Analiza oligomernega stanja#

Transkripcijsko aktivna oblika ESRRG je dimer.

  • Koliko verig je v asimetrični enoti?

  • So med verigami iz sosednjih asimetričnih enot obsežnejši kontakti, ki bi lahko kazali na to, da bi omogočali stabilno oligomerno stanje v raztopini? (Namig: uporabite strežnik PDBePISA.)

    • Model strukture shranite (Menu > Models > kliknite ikono za prenos).

Podatki pri nižji ločljivosti#

Oglejte si še, kako izgleda elektronska gostota pri nižji ločljivosti in sicer pri 3,2 Å. Gre za strukturo mišjega ESRRG v kompleksu z neko drugo spojino.

  1. Pobrišite vse, kar imate naloženo v Moorhen: Menu > File > Delete everything, ali preprosto ponovno naložite spletno stran.

  2. Naložite v zbirki deponiran model strukture in že izračunane karte elektronske gostote: Menu > File > Fetch from online services (PDBe) > 1VJB (vključite fetch data for map) > Fetch

  3. Oglejte si elektronsko gostoto in razmislite, kako je graditi model strukture pri taki ločljivosti…

Drugi viri#

Uporabljeni podatki#

Pri pripravi delavnice so bili uporabljeni naslednji modeli struktur in pripadajoči podatki:

  • PDB 2E2R, opisan v: A. Matsushima, Y. Kakuta, T. Teramoto, T. Koshiba, X. Liu, H. Okada, T. Tokunaga, S. Kawabata, M. Kimura, Y. Shimohigashi. 2007. Structural Evidence for Endocrine Disruptor Bisphenol A Binding to Human Nuclear Receptor ERRγ. The Journal of Biochemistry 142(4), 517–524. 10.1093/jb/mvm158

  • PDB 1VJB, opisan v: H. Greschik, R. Flaig, J.-P. Renaud, D. Moras. 2004. Structural Basis for the Deactivation of the Estrogen-related Receptor γ by Diethylstilbestrol or 4-Hydroxytamoxifen and Determinants of Selectivity. Journal of Biological Chemistry 279, 33639–33646. 10.1074/jbc.M402195200

Pri pripravi podatkov je bil uporabljen program Phenix [Liebschner et al., 2019].