S2-04

• Datum izdelave: 2026-05-08

• Koda seminarja: S2-04

Analiza selektivnosti in bakterijske rezistence na ciprofloksacin

1. del naloge

Raziskovalno vprašanje:

Kako mutacije zmanjšajo učinkovitost ciprofloksacina (razvijejo antibiotično rezistenco), ne da bi popolnoma uničile funkcijo DNA giraze?

Navodila:

1. Na spletu poišči, v katero skupino antibiotikov spada ciprofloksacin.

2. Podanih je 5 aminokislinskih zaporedij, ki vsebujejo mutacije. S pomočjo poravnav z WT GyrA iz E.coli določi, za katere mutacije gre (zaporedna št. in sprememba AK ostanka.)

Mutacija 1 MSDLAREITPVNIEEELKSSYLDYAMSVIVGRALPDVRDGLKPVHRRVLYAMNVLGNDWNKAYKKSSRVVGDVIGKYHPHGDSAVYDTIVRMAQPFSLRYMLVDGQGNFGSIDGDSAAAMRYTEIRLAKIAHELMADLEKETVDFVDNYDGTEKIPDVMPTKIPNLLVNGSSGIAVGMATNIPPHNLTEVINGCLAYIDDEDISIEGLMEHIPGPDFPTAAIINGRRGIEEAYRTGRGKVYIRARAEVEVDAKTGRETIIVHEIPYQVNKARLIEKIAELVKEKRVEGISALRDESDKDGMRIVIEVKRDAVGEVVLNNLYSQTQLQVSFGINMVALHHGQPKIMNLKDIIAAFVRHRREVVTRRTIFELRKARDRAHILEALAVALANIDPIIELIRHAPTPAEAKTALVANPWQLGNVAAMLERAGDDAARPEWLEPEFGVRDGLYYLTEQQAQAILDLRLQKLTGLEHEKLLDEYKELLDQIAELLRILGSADRLMEVIREELELVREQFGDKRRTEITANSADINLEDLITQEDVVVTLSHQGYVKYQPLSEYEAQRRGGKGKSAARIKEEDFIDRLLVANTHDHILCFSSRGRVYSMKVYQLPEATRGARGRPIVNLLPLEQDERITAILPVTEFEEGVKVFMATANGTVKKTVLTEFNRLRTAGKVAIKLVDGDELIGVDLTSGEDEVMLFSAEGKVVRFKESSVRAMGCNTTGVRGIRLGEGDKVVSLIVPRGDGAILTATQNGYGKRTAVAEYPTKSRATKGVISIKVTERNGLVVGAVQVDDCDQIMMITDAGTLVRTRVSEISIVGRNTQGVILIRTAEDENVVGLQRVAEPVDEEDLDTIDGSAAEGDDEIAPEVDVDDEPEEE

Mutacija 2 MSDLAREITPVNIEEELKSSYLDYAMSVIVGRALPDVRDGLKPVHRRVLYAMNVLGNDWNKAYKKSARVVGDVIGKYHPHCDSAVYDTIVRMAQPFSLRYMLVDGQGNFGSIDGDSAAAMRYTEIRLAKIAHELMADLEKETVDFVDNYDGTEKIPDVMPTKIPNLLVNGSSGIAVGMATNIPPHNLTEVINGCLAYIDDEDISIEGLMEHIPGPDFPTAAIINGRRGIEEAYRTGRGKVYIRARAEVEVDAKTGRETIIVHEIPYQVNKARLIEKIAELVKEKRVEGISALRDESDKDGMRIVIEVKRDAVGEVVLNNLYSQTQLQVSFGINMVALHHGQPKIMNLKDIIAAFVRHRREVVTRRTIFELRKARDRAHILEALAVALANIDPIIELIRHAPTPAEAKTALVANPWQLGNVAAMLERAGDDAARPEWLEPEFGVRDGLYYLTEQQAQAILDLRLQKLTGLEHEKLLDEYKELLDQIAELLRILGSADRLMEVIREELELVREQFGDKRRTEITANSADINLEDLITQEDVVVTLSHQGYVKYQPLSEYEAQRRGGKGKSAARIKEEDFIDRLLVANTHDHILCFSSRGRVYSMKVYQLPEATRGARGRPIVNLLPLEQDERITAILPVTEFEEGVKVFMATANGTVKKTVLTEFNRLRTAGKVAIKLVDGDELIGVDLTSGEDEVMLFSAEGKVVRFKESSVRAMGCNTTGVRGIRLGEGDKVVSLIVPRGDGAILTATQNGYGKRTAVAEYPTKSRATKGVISIKVTERNGLVVGAVQVDDCDQIMMITDAGTLVRTRVSEISIVGRNTQGVILIRTAEDENVVGLQRVAEPVDEEDLDTIDGSAAEGDDEIAPEVDVDDEPEEE

Mutacija 3 MSDLAREITPVNIEEELKSSYLDYAMSVIVGRALPDVRDGLKPVHRRVLYAMNVLGNDWNKAYKKSARVVGDVIGKYHPHGDLAVYDTIVRMAQPFSLRYMLVDGQGNFGSIDGDSAAAMRYTEIRLAKIAHELMADLEKETVDFVDNYDGTEKIPDVMPTKIPNLLVNGSSGIAVGMATNIPPHNLTEVINGCLAYIDDEDISIEGLMEHIPGPDFPTAAIINGRRGIEEAYRTGRGKVYIRARAEVEVDAKTGRETIIVHEIPYQVNKARLIEKIAELVKEKRVEGISALRDESDKDGMRIVIEVKRDAVGEVVLNNLYSQTQLQVSFGINMVALHHGQPKIMNLKDIIAAFVRHRREVVTRRTIFELRKARDRAHILEALAVALANIDPIIELIRHAPTPAEAKTALVANPWQLGNVAAMLERAGDDAARPEWLEPEFGVRDGLYYLTEQQAQAILDLRLQKLTGLEHEKLLDEYKELLDQIAELLRILGSADRLMEVIREELELVREQFGDKRRTEITANSADINLEDLITQEDVVVTLSHQGYVKYQPLSEYEAQRRGGKGKSAARIKEEDFIDRLLVANTHDHILCFSSRGRVYSMKVYQLPEATRGARGRPIVNLLPLEQDERITAILPVTEFEEGVKVFMATANGTVKKTVLTEFNRLRTAGKVAIKLVDGDELIGVDLTSGEDEVMLFSAEGKVVRFKESSVRAMGCNTTGVRGIRLGEGDKVVSLIVPRGDGAILTATQNGYGKRTAVAEYPTKSRATKGVISIKVTERNGLVVGAVQVDDCDQIMMITDAGTLVRTRVSEISIVGRNTQGVILIRTAEDENVVGLQRVAEPVDEEDLDTIDGSAAEGDDEIAPEVDVDDEPEEE

Mutacija 4 MSDLAREITPVNIEEELKSSYLDYAMSVIVGRALPDVRDGLKPVHRRVLYAMNVLGNDWNKAYKKSARVVGDVIGKYHPHGDSAVYNTIVRMAQPFSLRYMLVDGQGNFGSIDGDSAAAMRYTEIRLAKIAHELMADLEKETVDFVDNYDGTEKIPDVMPTKIPNLLVNGSSGIAVGMATNIPPHNLTEVINGCLAYIDDEDISIEGLMEHIPGPDFPTAAIINGRRGIEEAYRTGRGKVYIRARAEVEVDAKTGRETIIVHEIPYQVNKARLIEKIAELVKEKRVEGISALRDESDKDGMRIVIEVKRDAVGEVVLNNLYSQTQLQVSFGINMVALHHGQPKIMNLKDIIAAFVRHRREVVTRRTIFELRKARDRAHILEALAVALANIDPIIELIRHAPTPAEAKTALVANPWQLGNVAAMLERAGDDAARPEWLEPEFGVRDGLYYLTEQQAQAILDLRLQKLTGLEHEKLLDEYKELLDQIAELLRILGSADRLMEVIREELELVREQFGDKRRTEITANSADINLEDLITQEDVVVTLSHQGYVKYQPLSEYEAQRRGGKGKSAARIKEEDFIDRLLVANTHDHILCFSSRGRVYSMKVYQLPEATRGARGRPIVNLLPLEQDERITAILPVTEFEEGVKVFMATANGTVKKTVLTEFNRLRTAGKVAIKLVDGDELIGVDLTSGEDEVMLFSAEGKVVRFKESSVRAMGCNTTGVRGIRLGEGDKVVSLIVPRGDGAILTATQNGYGKRTAVAEYPTKSRATKGVISIKVTERNGLVVGAVQVDDCDQIMMITDAGTLVRTRVSEISIVGRNTQGVILIRTAEDENVVGLQRVAEPVDEEDLDTIDGSAAEGDDEIAPEVDVDDEPEEE

Mutacija 5 MSDLAREITPVNIEEELKSSYLDYAMSVIVGRALPDVRDGLKPVHRRVLYAMNVLGNDWNKAYKKSARVVGDVIGKYHPHGDSAVYDTIVRMAQPFSLRYMLVDGHGNFGSIDGDSAAAMRYTEIRLAKIAHELMADLEKETVDFVDNYDGTEKIPDVMPTKIPNLLVNGSSGIAVGMATNIPPHNLTEVINGCLAYIDDEDISIEGLMEHIPGPDFPTAAIINGRRGIEEAYRTGRGKVYIRARAEVEVDAKTGRETIIVHEIPYQVNKARLIEKIAELVKEKRVEGISALRDESDKDGMRIVIEVKRDAVGEVVLNNLYSQTQLQVSFGINMVALHHGQPKIMNLKDIIAAFVRHRREVVTRRTIFELRKARDRAHILEALAVALANIDPIIELIRHAPTPAEAKTALVANPWQLGNVAAMLERAGDDAARPEWLEPEFGVRDGLYYLTEQQAQAILDLRLQKLTGLEHEKLLDEYKELLDQIAELLRILGSADRLMEVIREELELVREQFGDKRRTEITANSADINLEDLITQEDVVVTLSHQGYVKYQPLSEYEAQRRGGKGKSAARIKEEDFIDRLLVANTHDHILCFSSRGRVYSMKVYQLPEATRGARGRPIVNLLPLEQDERITAILPVTEFEEGVKVFMATANGTVKKTVLTEFNRLRTAGKVAIKLVDGDELIGVDLTSGEDEVMLFSAEGKVVRFKESSVRAMGCNTTGVRGIRLGEGDKVVSLIVPRGDGAILTATQNGYGKRTAVAEYPTKSRATKGVISIKVTERNGLVVGAVQVDDCDQIMMITDAGTLVRTRVSEISIVGRNTQGVILIRTAEDENVVGLQRVAEPVDEEDLDTIDGSAAEGDDEIAPEVDVDDEPEEE

3. V Uniprot preveri, ali gre za mutacije, ki povzročijo odpornost na skupino antibiotikov, v katero spada ciprofloksacin. Ali so navedene še druge mutacije? V katerem delu so zgoščene (od…do)? Pobrskaj po spletu, kako se reče dani regiji.

4. Pripravi datoteko v FASTA formatu s 5 zaporedji za GyrA iz drugih organizmov, vključno z zaporedjem iz E.coli. Zaporedja naj bodo podobne dolžine.

5. Naredi poravnavo in za lažjo vizualizacijo pripravi tudi Sequence logo

• Kje se pojavljajo mutacije? V ohranjenih ali neohranjenih delih encima?

• Ali se mutacije pojavljajo v pomembni domeni ali v aktivnem mestu encima? Zakaj da oz. ne?

6. V strukturi WT proteina poišči AK ostanke, mutacije katerih povzročijo rezistenco. Ali se nahajajo blizu vezavnega ali aktivnega mesta? Ali so na površini ali v notranjosti encima?

7. Glede na ugotovitve predlagaj mehanizem delovanja antibiotika. Kako mutacije učinkujejo proti njemu? Kakšno vlogo imajo ohranjene regije?

Namig: spojina se ne veže neposredno samo na protein. Pomisli še na kofaktor, ki ga potrebuje encim.

2. del naloge

Raziskovalno vprašanje

Zakaj ciprofloksacin učinkovito deluje na bakterijsko DNA girazo in ne na človeško topoizomerazo II?

Navodila

1. V Uniprot poišči zaporedje za podenoto A DNA giraze iz E.coli, podenoto A topoizomeraze IV iz E.coli ter človeško topoizomerazo II.

2. Za tri proteine zapiši naslednje informacije:

• Accession code

• Funkcijo

• Dolžino

• Aminokislinski ostanek v aktivnem mestu

3. Naredi MSA (lahko kar v Uniprot) in analiziraj podobnost. Odgovori:

• Ali sta si bakterijski tarči antibiotika bolj podobni druga drugi kot človeški protein? Razloži podobnosti/razlike.

• Ali se razlikujejo aminokislinski ostanki v aktivnem mestu?

4. Primerjaj tudi strukture treh proteinov. Ali so si kaj podobne?

5. Glede na ugotovitve v prejšnjem delu naloge preveri, ali so pomembni aminokislinski ostanki (tisti, ki ob mutaciji povzročijo rezistenco) enaki tudi pri človeku?

6. Na poldagi vseh ugotovitev sklepaj, kako pride do selektivnosti antibiotika?