# S2-04

- **Datum izdelave**: 2026-05-08 
- **Koda seminarja**: S2-04

## Analiza selektivnosti in bakterijske rezistence na ciprofloksacin
### 1. del naloge
### Raziskovalno vprašanje: 
Kako mutacije zmanjšajo učinkovitost ciprofloksacina (razvijejo antibiotično rezistenco), ne da bi popolnoma uničile funkcijo DNA giraze?
### Navodila:
1. Na spletu poišči, v katero skupino antibiotikov spada ciprofloksacin.
2. Podanih je 5 aminokislinskih zaporedij, ki vsebujejo mutacije. S pomočjo poravnav z WT GyrA iz *E.coli* določi, za katere mutacije gre (zaporedna št. in sprememba AK ostanka.)

>Mutacija 1
MSDLAREITPVNIEEELKSSYLDYAMSVIVGRALPDVRDGLKPVHRRVLYAMNVLGNDWNKAYKKSSRVVGDVIGKYHPHGDSAVYDTIVRMAQPFSLRYMLVDGQGNFGSIDGDSAAAMRYTEIRLAKIAHELMADLEKETVDFVDNYDGTEKIPDVMPTKIPNLLVNGSSGIAVGMATNIPPHNLTEVINGCLAYIDDEDISIEGLMEHIPGPDFPTAAIINGRRGIEEAYRTGRGKVYIRARAEVEVDAKTGRETIIVHEIPYQVNKARLIEKIAELVKEKRVEGISALRDESDKDGMRIVIEVKRDAVGEVVLNNLYSQTQLQVSFGINMVALHHGQPKIMNLKDIIAAFVRHRREVVTRRTIFELRKARDRAHILEALAVALANIDPIIELIRHAPTPAEAKTALVANPWQLGNVAAMLERAGDDAARPEWLEPEFGVRDGLYYLTEQQAQAILDLRLQKLTGLEHEKLLDEYKELLDQIAELLRILGSADRLMEVIREELELVREQFGDKRRTEITANSADINLEDLITQEDVVVTLSHQGYVKYQPLSEYEAQRRGGKGKSAARIKEEDFIDRLLVANTHDHILCFSSRGRVYSMKVYQLPEATRGARGRPIVNLLPLEQDERITAILPVTEFEEGVKVFMATANGTVKKTVLTEFNRLRTAGKVAIKLVDGDELIGVDLTSGEDEVMLFSAEGKVVRFKESSVRAMGCNTTGVRGIRLGEGDKVVSLIVPRGDGAILTATQNGYGKRTAVAEYPTKSRATKGVISIKVTERNGLVVGAVQVDDCDQIMMITDAGTLVRTRVSEISIVGRNTQGVILIRTAEDENVVGLQRVAEPVDEEDLDTIDGSAAEGDDEIAPEVDVDDEPEEE

>Mutacija 2
MSDLAREITPVNIEEELKSSYLDYAMSVIVGRALPDVRDGLKPVHRRVLYAMNVLGNDWNKAYKKSARVVGDVIGKYHPHCDSAVYDTIVRMAQPFSLRYMLVDGQGNFGSIDGDSAAAMRYTEIRLAKIAHELMADLEKETVDFVDNYDGTEKIPDVMPTKIPNLLVNGSSGIAVGMATNIPPHNLTEVINGCLAYIDDEDISIEGLMEHIPGPDFPTAAIINGRRGIEEAYRTGRGKVYIRARAEVEVDAKTGRETIIVHEIPYQVNKARLIEKIAELVKEKRVEGISALRDESDKDGMRIVIEVKRDAVGEVVLNNLYSQTQLQVSFGINMVALHHGQPKIMNLKDIIAAFVRHRREVVTRRTIFELRKARDRAHILEALAVALANIDPIIELIRHAPTPAEAKTALVANPWQLGNVAAMLERAGDDAARPEWLEPEFGVRDGLYYLTEQQAQAILDLRLQKLTGLEHEKLLDEYKELLDQIAELLRILGSADRLMEVIREELELVREQFGDKRRTEITANSADINLEDLITQEDVVVTLSHQGYVKYQPLSEYEAQRRGGKGKSAARIKEEDFIDRLLVANTHDHILCFSSRGRVYSMKVYQLPEATRGARGRPIVNLLPLEQDERITAILPVTEFEEGVKVFMATANGTVKKTVLTEFNRLRTAGKVAIKLVDGDELIGVDLTSGEDEVMLFSAEGKVVRFKESSVRAMGCNTTGVRGIRLGEGDKVVSLIVPRGDGAILTATQNGYGKRTAVAEYPTKSRATKGVISIKVTERNGLVVGAVQVDDCDQIMMITDAGTLVRTRVSEISIVGRNTQGVILIRTAEDENVVGLQRVAEPVDEEDLDTIDGSAAEGDDEIAPEVDVDDEPEEE

>Mutacija 3
MSDLAREITPVNIEEELKSSYLDYAMSVIVGRALPDVRDGLKPVHRRVLYAMNVLGNDWNKAYKKSARVVGDVIGKYHPHGDLAVYDTIVRMAQPFSLRYMLVDGQGNFGSIDGDSAAAMRYTEIRLAKIAHELMADLEKETVDFVDNYDGTEKIPDVMPTKIPNLLVNGSSGIAVGMATNIPPHNLTEVINGCLAYIDDEDISIEGLMEHIPGPDFPTAAIINGRRGIEEAYRTGRGKVYIRARAEVEVDAKTGRETIIVHEIPYQVNKARLIEKIAELVKEKRVEGISALRDESDKDGMRIVIEVKRDAVGEVVLNNLYSQTQLQVSFGINMVALHHGQPKIMNLKDIIAAFVRHRREVVTRRTIFELRKARDRAHILEALAVALANIDPIIELIRHAPTPAEAKTALVANPWQLGNVAAMLERAGDDAARPEWLEPEFGVRDGLYYLTEQQAQAILDLRLQKLTGLEHEKLLDEYKELLDQIAELLRILGSADRLMEVIREELELVREQFGDKRRTEITANSADINLEDLITQEDVVVTLSHQGYVKYQPLSEYEAQRRGGKGKSAARIKEEDFIDRLLVANTHDHILCFSSRGRVYSMKVYQLPEATRGARGRPIVNLLPLEQDERITAILPVTEFEEGVKVFMATANGTVKKTVLTEFNRLRTAGKVAIKLVDGDELIGVDLTSGEDEVMLFSAEGKVVRFKESSVRAMGCNTTGVRGIRLGEGDKVVSLIVPRGDGAILTATQNGYGKRTAVAEYPTKSRATKGVISIKVTERNGLVVGAVQVDDCDQIMMITDAGTLVRTRVSEISIVGRNTQGVILIRTAEDENVVGLQRVAEPVDEEDLDTIDGSAAEGDDEIAPEVDVDDEPEEE

>Mutacija 4
MSDLAREITPVNIEEELKSSYLDYAMSVIVGRALPDVRDGLKPVHRRVLYAMNVLGNDWNKAYKKSARVVGDVIGKYHPHGDSAVYNTIVRMAQPFSLRYMLVDGQGNFGSIDGDSAAAMRYTEIRLAKIAHELMADLEKETVDFVDNYDGTEKIPDVMPTKIPNLLVNGSSGIAVGMATNIPPHNLTEVINGCLAYIDDEDISIEGLMEHIPGPDFPTAAIINGRRGIEEAYRTGRGKVYIRARAEVEVDAKTGRETIIVHEIPYQVNKARLIEKIAELVKEKRVEGISALRDESDKDGMRIVIEVKRDAVGEVVLNNLYSQTQLQVSFGINMVALHHGQPKIMNLKDIIAAFVRHRREVVTRRTIFELRKARDRAHILEALAVALANIDPIIELIRHAPTPAEAKTALVANPWQLGNVAAMLERAGDDAARPEWLEPEFGVRDGLYYLTEQQAQAILDLRLQKLTGLEHEKLLDEYKELLDQIAELLRILGSADRLMEVIREELELVREQFGDKRRTEITANSADINLEDLITQEDVVVTLSHQGYVKYQPLSEYEAQRRGGKGKSAARIKEEDFIDRLLVANTHDHILCFSSRGRVYSMKVYQLPEATRGARGRPIVNLLPLEQDERITAILPVTEFEEGVKVFMATANGTVKKTVLTEFNRLRTAGKVAIKLVDGDELIGVDLTSGEDEVMLFSAEGKVVRFKESSVRAMGCNTTGVRGIRLGEGDKVVSLIVPRGDGAILTATQNGYGKRTAVAEYPTKSRATKGVISIKVTERNGLVVGAVQVDDCDQIMMITDAGTLVRTRVSEISIVGRNTQGVILIRTAEDENVVGLQRVAEPVDEEDLDTIDGSAAEGDDEIAPEVDVDDEPEEE

>Mutacija 5
MSDLAREITPVNIEEELKSSYLDYAMSVIVGRALPDVRDGLKPVHRRVLYAMNVLGNDWNKAYKKSARVVGDVIGKYHPHGDSAVYDTIVRMAQPFSLRYMLVDGHGNFGSIDGDSAAAMRYTEIRLAKIAHELMADLEKETVDFVDNYDGTEKIPDVMPTKIPNLLVNGSSGIAVGMATNIPPHNLTEVINGCLAYIDDEDISIEGLMEHIPGPDFPTAAIINGRRGIEEAYRTGRGKVYIRARAEVEVDAKTGRETIIVHEIPYQVNKARLIEKIAELVKEKRVEGISALRDESDKDGMRIVIEVKRDAVGEVVLNNLYSQTQLQVSFGINMVALHHGQPKIMNLKDIIAAFVRHRREVVTRRTIFELRKARDRAHILEALAVALANIDPIIELIRHAPTPAEAKTALVANPWQLGNVAAMLERAGDDAARPEWLEPEFGVRDGLYYLTEQQAQAILDLRLQKLTGLEHEKLLDEYKELLDQIAELLRILGSADRLMEVIREELELVREQFGDKRRTEITANSADINLEDLITQEDVVVTLSHQGYVKYQPLSEYEAQRRGGKGKSAARIKEEDFIDRLLVANTHDHILCFSSRGRVYSMKVYQLPEATRGARGRPIVNLLPLEQDERITAILPVTEFEEGVKVFMATANGTVKKTVLTEFNRLRTAGKVAIKLVDGDELIGVDLTSGEDEVMLFSAEGKVVRFKESSVRAMGCNTTGVRGIRLGEGDKVVSLIVPRGDGAILTATQNGYGKRTAVAEYPTKSRATKGVISIKVTERNGLVVGAVQVDDCDQIMMITDAGTLVRTRVSEISIVGRNTQGVILIRTAEDENVVGLQRVAEPVDEEDLDTIDGSAAEGDDEIAPEVDVDDEPEEE

3. V Uniprot preveri, ali gre za mutacije, ki povzročijo odpornost na skupino antibiotikov, v katero spada ciprofloksacin. Ali so navedene še druge mutacije? V katerem delu so zgoščene (od…do)? Pobrskaj po spletu, kako se reče dani regiji.
4. Pripravi datoteko v FASTA formatu s 5 zaporedji za GyrA iz drugih organizmov, vključno z zaporedjem iz *E.coli*. Zaporedja naj bodo podobne dolžine. 
5. Naredi poravnavo in za lažjo vizualizacijo pripravi tudi Sequence logo

* Kje se pojavljajo mutacije? V ohranjenih ali neohranjenih delih encima?
* Ali se mutacije pojavljajo v pomembni domeni ali v aktivnem mestu encima? Zakaj da oz. ne?
6. V strukturi WT proteina poišči AK ostanke, mutacije katerih povzročijo rezistenco. Ali se nahajajo blizu vezavnega ali aktivnega mesta? Ali so na površini ali v notranjosti encima?
7. Glede na ugotovitve predlagaj mehanizem delovanja antibiotika. Kako mutacije učinkujejo proti njemu?  Kakšno vlogo imajo ohranjene regije? 

**Namig**: spojina se ne veže neposredno samo na protein. Pomisli še na kofaktor, ki ga potrebuje encim.

## 2. del naloge
### Raziskovalno vprašanje 
Zakaj ciprofloksacin učinkovito deluje na bakterijsko DNA girazo in ne na človeško topoizomerazo II?

### Navodila
1. V Uniprot poišči zaporedje za podenoto A DNA giraze iz *E.coli*, podenoto A topoizomeraze IV iz *E.coli* ter človeško topoizomerazo II.
2. Za tri proteine zapiši naslednje informacije:
* Accession code
* Funkcijo
* Dolžino
* Aminokislinski ostanek v aktivnem mestu

3. Naredi MSA (lahko kar v Uniprot) in analiziraj podobnost. Odgovori:
* Ali sta si bakterijski tarči antibiotika bolj podobni druga drugi kot človeški protein? Razloži podobnosti/razlike.
* Ali se razlikujejo aminokislinski ostanki v aktivnem mestu? 
4. Primerjaj tudi strukture treh proteinov. Ali so si kaj podobne?
5. Glede na ugotovitve v prejšnjem delu naloge preveri, ali so pomembni aminokislinski ostanki (tisti, ki ob mutaciji povzročijo rezistenco) enaki tudi pri človeku? 
6. Na poldagi vseh ugotovitev sklepaj, kako pride do selektivnosti antibiotika?