Med digitalizacijo arhiva stare raziskovalne skupine, ki se je ukvarjala z analizo mlečnih proteinov pri sesalcih, so raziskovalci naleteli na poškodovan laboratorijski zapis. Večina originalne dokumentacije je bila zaradi razlite kemikalije neberljiva, vendar so raziskovalci kljub temu uspeli razbrati del aminokislinskega zaporedja ter nekaj kratkih eksperimentalnih opomb.#
Po ohranjenih zapisih naj bi bil protein močno izražen v mlečnih žlezah med laktacijo. Zapis prav tako pravi, da protein najverjetneje ne deluje kot klasičen encim, temveč sodeluje pri uravnavanju aktivnosti drugega proteina.#
1. Zapiši ime proteina, ki mu pripada to aminokislinsko zaporedje.#
2. Iz katerega organizma je bil dani protein izoliran?#
3. Kateri gen kodira za dani protein ter na katerem kromosomu se ta gen nahaja?#
4. Koliko aminokislinskih ostankov tvori zrel protein?#
5. Mleko organizma iz katerega je bil izoliran protein ima pH približno 6,6. Kakšen naboj imajo aminokislinski ostanki proteina, ki se nahaja v tem biološkem okolju?#
Med nadaljnjo analizo so raziskovalci opazili zanimivo lastnost analiziranega proteina. Po zaporedju je namreč podoben določenim encimom prirojene imunosti. Ta ugotovitev nakazuje na to, da se je protein evolucijsko najbrž razvil iz starejšega encima. Med evolucijo je najverjetneje prišlo do duplikacije gena, pri čemer je eden ohranil svoj originalni zapis, drugi pa je bil podvržen genetskim spremembam. Te pa so privedle do izgube encimske aktivnosti in nastanka proučevanega proteina s povsem drugačno biološko funkcijo.#
3. Določite aminokislinske ostanke, ki tvorijo aktivno mesto encima. Ali so ti ostanki ohranjeni tudi v analiziranem proteinu oz. s katerimi ostanki so zamenjani? Ostanke zapišite z enočrkovnimi kodami.#
4. Primerjajte tridimenzionalni strukturi obeh proteinov in določite RMSD vrednost njune poravnave (zapiši vrednost “between pruned pairs”). Za strukture uporabi tiste, ki so navedene kot prve eksperimentalno določene v zbirki UniProt.#
5. Ali je med proteinoma bolj ohranjena struktura ali zaporedje? Ali je takšna ugotovitev smiselna?#
Raziskovalci so sumili, da je kljub izgubi encimske aktivnosti protein dobil novo biološko vlogo, in sicer so iz ohranjenih zapisov sklepali, da to nalogo opravlja ravno v mlečnih žlezah. V ta namen so v laboratoriju dani protein izolirali in preverili njegove interakcije z drugimi proteini, ki so prisotni v mlečnih žlezah med laktacijo. Ugotovili so, da gre za regulatorni protein, ki uravnava katalitsko aktivnost drugega proteina s katerim tvori funkcionalni kompleks, ključen med laktacijo.#
1. Kateri protein predstavlja interakcijskega partnerja analiziranega proteina? Navedi le tistega člana proteinske družine, ki je zmožen interakcije z analiziranim proteinom.#
2. Kako se imenuje kompleks, ki ga tvorita proteina?#
3. Kaj je produkt encimske aktivnosti tega kompleksa?#
4. Kako vezava regulatornega proteina vpliva na substratno specifičnost drugega encima?#
5. Poiščite mRNA zapis za protein s katalitsko funkcijo in navedite “accession code” transkripta X1.#
Laboratorij želi ustvariti gensko spremenjeno celico, ki bi proizvajala mleko brez končnega produkta encimske aktivnosti opisanega kompleksa. Ker je za sintezo tega produkta nujna interakcija med obema proteinoma, želijo raziskovalci z mutacijo destabilizirati proteinski kompleks.#
1. Kateri aminokislinski ostanek bi bilo najbolj smiselno mutirati, da bi oslabili interakcijo med proteinoma?#
2. S katerim aminokislinskim ostankom bi ga zamenjali in zakaj?#
Pri reševanju tega problema si pomagaj z orodjem PDBsum, ki omogoča analizo interakcij med polipeptidnimi verigami v proteinskih kompleksih ter prikaz aminokislinskih ostankov, ki sodelujejo pri teh interakcijah. Orodje je dostopno na povezavi: https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/.#
Ker je analiza interakcij z generiranjem kompleksa med proteinoma iz preučevanega organizma lahko zelo zamudna (struktura namreč ni znana), za analizo uporabi strukturo, ki je v PDB podana pod kodo 1NHE. V tej strukturi je regulatorni protein mišjega izvora, protein s katalitsko funkcijo pa izvira iz goveda. Ker imata oba proteina visoko sekvenčno podobnost s pripadajočim homologom našega preučevanega organizma, lahko predpostavimo, da so interakcije med proteini zelo podobne.#
Po vnosu PDB kode odpri v orodni vrstici zavihek “Prot-Prot”, kjer so prikazane interakcije med proteinskimi verigami. Opaziš lahko, da struktura vsebuje asimetrično enoto z dvema heterodimeroma. Pod razdelkom “interface summary” poišči interakcijo med verigama A in B (ti dve tvorita enega izmed prikazanih heterodimerov) ter na podlagi teh podatkov odgovori na zgornji vprašanji. Nato odgovori še na spodnje vprašanje.#
3. Ali je število interakcij med proteinoma enako pri obeh heterodimerih v asimetrični enoti? Zakaj meniš, da je temu tako?#
