Od sekvence do strukture: celosten pristop k proučevanju proteina BRCA1

Od sekvence do strukture: celosten pristop k proučevanju proteina BRCA1#

#Opis problema Gen BRCA1 (brest cancer 1) ima ključno vlogo pri popravljanju dvojnih prelomov DNA, torej pri stabilnosti genoma. Mutacije v tem genu so povezane s povečanim tveganjem za raka dojk in jajčnikov, zato njegovo raziskovanje ni le akademsko zanimivo, temveč ima tudi neposreden vpliv na življenje ljudi. Ker te to področje zelo zanima, si se odločil poglobiti v ta protein in vlogo določenih mutacij. V tej nalogi boš prevzel vlogo bioinformatika in molekularnega biologa, analiziral boš zaporedje BRCA1, iskal evolucijsko ohranjene regije, raziskoval poznane mutacije in se vprašal, kaj te mutacije pomenijo za funkcijo proteinov.

#Navodilo za delo

  1. Poišči zapis za človeški protein BRCA1.

  • Zapiši UniProt ID za ta protein:

  • Zapiši dolžino proteina:

  • Kaj je naloga tega proteina?

  • Katere vrste mutacij najdemo pri raku dojk?

  1. Za analiziranje mutacij si želimo izolirati protein BRCA1.

  • Iz katerega dela celice bi morali izolirati protein BRCA1 za njegovo analizo?

  • Zapiši PDB ID za BRCA1 strukturo, ki je bila določena z NMR analizo:

  • Koliko meren je ta protein?

  • Protein smo izolirali tako, da smo celice spirali s PBS, nato dodali litični pufer RIPA z dodatkom proteaznih inhibitorjev. Po inkubaciji na ledu in centrifugiranju smo shranili supernatant. Za učinkovito izolacijo smo izvedli afinitetno kromatografijo. Čistost izoliranega proteina želimo potrditi z SDS-page, pri kateri velikosti pričakujemo liso na gelu?

  1. Za aktivnost BRCA1 proteina sta ključni dve domeni, in sicer BRCT ter RING.

  • kje na proteinu se nahaja BRCT domena?

  • Kje na proteinu se nahaja RING domena? Kateri ion je ključen za aktivnost te domene?

  1. Analiziranje mutacij.

  • Za vsako izmed omenjenih domen izberi po eno patogeno mutacijo. Opiši, kaj se pri tej mutaciji zgodi in dodaj DOI enega izmed preiskovalnih (research) člankov na PubMedu, ki omenja to mutacijo.

  • Želimo preveriti, kako dobro je ohranjena BRCT1 domena med sesalci. Zapiši imena organizmov, ki vsebujejo homolog te domene. (za database uporabi swisssprot)

  • Ali je pri vseh teh organizmih ohranjena mutacija na mestu 1699?

  1. Poravnava

  • Želimo si ogledati ohranjenost celotenga proteina pri miših. Naredi poravnavo celotnega zapisa za človeški in mišji protein BRCA1 ter zapiši procent podobnosti med njima.