S06

• Avtor: Uma Jordan Ferbežar

• Datum izdelave: 2024-05-17

• Koda seminarja: S06

---

Vhodni podatek

Povezava do datoteke z vhodnim podatkom: S06

---

Rezultati analiz

Iskanje tarčnega proteina

Nukleotidno zaporedje vključka sem vnesla v blastx in iskala po bazi Non-redundant protein sequences. Tarčni protein sem identificirala kot domnevni seralizin (putative serralysin), ki se nahaja v negojeni bakteriji Defluviicoccus sp.. Identičnost je 99.80%, zato predvidevam, da gre v vključku za skoraj celotno zaporedje tega proteina.

S podatki, pridobljenimi iz GenBank-a sem ugotovila, da gre za 628 aminokislin dolg protein. Spada med od cinka odvisne metaloproteaze in v poddružino seralizinu podobnih proteinov, ki so pri bakterijah pomembni virulenčni faktorji. Ima tudi vezavna mesta za kalcijeve ione.

Aminokislinsko zaporedje domnevnega seralizina sem vnesla še v InterPro, da bi identificirala pomembne domene. Rezultati analize so med drugim pokazali seralizinu podobno metalopeptidazno domeno.

Iskanje bolje anotiranega proteina

Ker domnevni seralizin ni najbolje anotiran, sem se v blastp z iskanjem po bazi UniProtKB/Swiss-Prot odločila poiskati sorodnega. Našla sem protein seralizin C (Serralysin C), ki je dobro anotiran in preverjen v UniProt-u.

Tudi zaporedje tega proteina sem vnesla v InterPro, rezultati analize so prav tako pokazali seralizinu podobno metalopeptidazno domeno.

Lastnosti proteina

Na večino lastnosti domnevnega seralizina sem sklepala iz anotiranih zapisov za soroden protein, seralizin C iz organizma Dickeya chrysanthemi (UniProt ID: P16317), ki je dolg 479 AK in ima maso prbl. 52 kDa. Gre za metaloproteazo (seralizin C ima aktivno mesto na mestu 189), ki preferenčno cepi vezi s hidrofobnimi ostanki v P1’. Njegovi kofaktorji so kalcijevi ioni, za katere ima seralizin C na podenoto 7 vezavnih mest, in cinkovi ioni, za katere ima na podenoto eno vezavno mesto. Nahaja se v ekstracelularnem matriksu (alternativno ime seralizina C je tudi izločena proteaza C oz. secreted protease C). Seralizin C se sprva nahaja v neaktivni obliki, po odcepu 17 AK dolgega propeptida pa preide v aktivno obliko. Sestavljen je iz 𝛼-heliksov in 𝛽-trakov ter ima tri kalcij vezavne hemolizinu podobne ponovitve (hemolysin-type calcium-binding), ki so bogate z glicinom in so verjetno pomembne za izločanje tega proteina iz celice.

Sorodni proteini & ohranjene domene

Sorodne proteine sem poiskala tako, da sem v blastp po bazi Non-redundant protein sequences z AK zaporedjem domnevnega seralizina poiskala 10 podobnih proteinov in poravnane sekvence - Download -> FASTA(aligned sequences) - vnesla v program Clustal Omega, ki je pripravil grafični prikaz poravnave ter podatke za filogenetsko drevo, ki sem jih vnesla v program phylo.io. Na spodnji sliki je del poravnave iz programa Clustal Omega.

Kot lahko vidimo iz filogenetskega drevesa (program phylo.io), je domnevni seralizin najbolj podoben metalopeptidazi s C-končno domeno (družina M10), ki se nahaja v organizmu Accumulibacter sp.. Tarčni protein je uokvirjen z modro, najbolj podoben pa z rdečo barvo.

Za prikaz ohranjenih domen sem poravnane sekvence iz blastp vnesla v program Cobalt Alignment, nato pa rezultat te analize - Download alignment -> Fasta plus gaps - vnesla v program Weblogo. Večje, kot so črke, ki označujejo AK ostanke, bolj ohranjeni so ti ostanki; vidimo lahko veliko ohranjenih glicinov, pa tudi asparaginov in aspartatov. Na pomembnost glicinov za funkcijo proteina sem sklepala že glede na podatke o seralizinu C, ta analiza pa moj sklep še dodatno potrdi.

Podobni evkariontski proteini

Z iskanjem v blastp po bazi Non-redundant protein sequences ali Protein Data Bank Proteins nisem dobila nobenih relevantnih rezultatov, pri iskanju po bazi UniProtKB/Swiss-Prot pa sem dobila en zadetek za evkariontski protein cinkova metaloproteaza nas-26 (zinc metalloproteinase nas-26), kjer je identičnost 33.33%. Protein se nahaja v organizmu Caenorhabditis elegans, ki je vrsta gliste in pogost modelni organizem. Tudi ta protein ima vezavna mesta za cinkove ione, nahaja se v ekstracelularnem matriksu in ima metaloproteazno aktivnost.

Medproteinske interakcije

Za analizo medproteinskih interakcij sem uporabila program STRING. Ker organizma Defluviicoccus sp. ni v njihovi bazi, sem za analizo uporabila protein seralizin C iz organizma Dickeya chrysanthemi. Na spodnjih slikah so prikazani proteini, s katerimi bi seralizin C potencialno lahko interagiral, na primer še nekaj drugih metaloproteaz, metaloproteazni inhibitor in ATPaze ter drugi proteini sekrecijskega sistema celice.

Pri enaki analizi evkariontskega proteina pa vidimo, da je ta povezan z veliko proteini, ki imajo domeno lektinov tipa C (oz. so sami lektini tipa C).

Struktura domnevnega seralizina in superpozicija

Strukturo domnevnega seralizina sem pripravila v programu AlphaFold3, ki nam napove 3D strukturo proteina, jo naložila na računalnik in nato odprla v programu MolStar. Protein je sestavljen iz večih 𝛼-heliksov in 𝛽-trakov, ki tvorijo 𝛽-ploskev.

Superpozicijo sem naredila najprej s seralizinom C (prokariontski protein). Vidimo lahko, da se strukturi precej dobro ujemata.

Ker struktura evkariontskega proteina še ni eksperimentalno določena, sem jo najprej pripravila v programu AlphaFold3.

Spodnja slika je prikaz superpozicije domnevnega seralizina z evkariontskim proteinom v MolStar-u. Vidimo lahko, da se ta dva proteina tudi po strukturi ne ujemata najbolje.