# S1-15 - **Datum izdelave**: 2026-05-07 - **Koda seminarja**: S1-15 ## Kdo reže DNA? CRISPR-Cas je obrambni sistem, s katerim se lahko bakterije in arheje obranijo pred okužbami z bakteriofagi ali drugimi genskimi elementi. Sekvenciral si del genoma neznane bakterije, za katerega sumiš, da vsebuje gene povezane s CRISPR-Cas obrambnim sistemom ter dobil sledeče zaporedje: ``` TTCTAAGCATTCAAAGACAATCAGTTCTGTAATCGTAGCAACCAATTTGTCAATCATCGA TTTCACTTCGGGTTTCTCATTAAATTGAGATTCTAAATCTGCATGAATCAATTTTAAAAT GGTTGAGGAGTTAACATCAAATCCTAAAATATCTGTTACAAGCATGATTTCTGATTCTTT GATTGTTTTCATCTTGTGATCAAAAAATTTAAGTTCAGAATCTTCCTCATATTTGTAACA ATATTGCACTATTTTTGAAAATACACAGACATCTTCGAGCACAAGAATTGTACCGCCTCT TAATGGAATCGGTTCATCTAATAAGGGAAAATTAAGATTCATCAAAAGCCTCCCCAAGAA ATACAAGTCTCTCATCGGAGTTTGCAATACAATTATTTCTTTCACCATGTAAATAAATCA TTCGTGCAAACTGTTTTTCTGTGACTGTTAGTAATGTAATATTTCCTTTATGAGGATTAT GCTCCCTCAGCCGACCAATCATGGCGTTGTTAGCTGTATTATTCAACAGTAACTTACTAT AAATAGAAAATTGATGCATGATAAACCCTTCACTAAGTAAAAATTTCCGAAATTTTCGAT AAGCTTTTCGTTCCTCAGCAGTGTCCGTCGGCATATCAAACATAAGTATCATTCTCATAT ATCTATAACTCATATCCTAAATTCAGGAACTCCTTTCCCTTCATTATTCAGAGCTTTGAC AACTTTTTTAGTATAATCGCTAATAATATTCGTGAGATACATCTCTTTACCATTATATGA AAATGTATCTGAAAACAAAGTAAATAACTCTCTCTTTATTTTGGGAAAAGGCTGATTTCG ATTTTCATAAACAATCTTATCCACCAAAGGCCTAAATGGTTCCATAATATCGCTAGCAAA ATTGAACTGATTAAACTGATTGGCGTGTTTGAGTCCAAATTGAGTCATACATCCAGACAC AACCACTTCACGCGCAAACATACTCAATAATAAAGTATAACCATAATCCAGACCTGCATT GATTGGATGCTCCAAATCTCTTGAGAAATCGTTCCCAAAAAGTGTATTAAAATAAATTCT CGCTGCATGCCCTTCTCGATTACTCGGATCAAAATTTTCCAAACCATGATATAAATCCAT AATAGATTGGGATTTTTCAAAATAGGAGCATGCTCCTAGATAGCAAGATTGATTCAAAAT CTTTTGAGCAATAATCGTCGTCCAAACCTGCGATTTGACTGTTTCTGACCAGGACATTTG TTTCCCAAGCTGTAAACTCGAATCATGACGACCATAAAAAGGCATCAGCATAGCTGTTGG TAATCGTTTATCATCACAGAATATGACAAGGACATTCTCATCCACTAGCCGTTTTACCAG CATAGTGGACAAGACAATATCGGTCGTTTCTAATAACAAAATATCAATTTCTGATAAATG GATCAGCTCCGTTTTATAGGCATCCTTAAAAATCAGATGATTATTCTTATAGGATAATTT CGAGTGGGTATTTACCACAACAGTACGCCAACCAGCCATTCAGTCACCTCCTAGCTGACT CAAATCAATGCGTGTTTCATAAAGACCAGTAATGGATTGATGGATAAGAGTGGCATCTAA AACTTCTTTTGTAGACGTATATCGTTTACGATCAATTGTTGTATCAAAATATTTAAAAGC AGCGGGAGCTCCAAGATTCGTCAACGTAAATAAATGAATAATATTTTCTGCTTGTTCACG TATTGGTTTGTCTCTATGTTTGTTATATGCACTAAGAACTTTATCTAAATTGGCATCTGC TAAAATAACACGCTTAGAAAATTCACTGATTTGCTCAATAATCTCATCTAAATAATGCTT ATGCTGCTCCACAAACAATTGTTTTTGTTCGTTATCTTCTGGACTACCCTTCAACTTTTC ATAATGACTAGCTAAATATAAAAAATTCACATATTTGCTTGGCAGAGCCAGCTCATTTCC TTTTTGCAATTCCCCGGCGCTAGCCAGCATCCGTTTACGACCGTTTTCTAACTCAAAAAG ACTATATTTAGGTAGTTTAATGATTAAATCTTTTCTAACTTCCTTATATCCTTTAGCTTC TAAAAAGTCAATCGGATTTTTTTCAAAGGAACTTCTTTCCATAATTGTGATCCCTAGTAA CTCTTTAACGGATTTTAACTTCTTCGATTTCCCTTTTTCCACCTTAGCAACCACTAGGAC TGAATAAGCTACCGTTGGACTATCAAAACCACCATATTTTTTTGGATCCCAGTCTTTTTT ACGAGCAATAAGCTTGTCCGAATTTCTTTTTGGTAAAATTGACTCCTTGGAGAATCCGCC TGTCTGTACTTCTGTTTTCTTGACAATATTGACTTGGGGCATGGACAATACTTTGCGCAC TGTGGCAAAATCTCGCCCTTTATCCCAGACAATTTCTCCAGTTTCCCCATTAGTTTCGAT TAGAGGGCGTTTGCGAATCTCTCCATTTGCAAGTGTAATTTCTGTTTTGAAGAAGTTCAT GATATTAGAGTAAAAGAAATATTTTGCGGTTGCTTTGCCTATTTCCTGCTCAGACTTAGC AATCATTTTACGAACATCATAAACTTTATAATCACCATAGACAAACTCCGATTCAAGTTT TGGATATTTCTTAATCAAAGCAGTTCCAACGACGGCATTAAGATACGCATCATGGGCATG ATGGTAATTGTTAATCTCACGTACTTTATAGAATTGGAAATCTTTTCGGAAGTCAGAAAC TAATTTAGATTTTAAGGTAATCACTTTAACCTCTCGAATAAGTTTATCATTTTCATCGTA TTTAGTATTCATGCGACTATCCAAAATTTGTGCCACATGCTTAGTGATTTGGCGAGTTTC AACCAATTGGCGTTTGATAAAACCAGCTTTATCAAGTTCACTCAAACCTCCACGTTCAGC TTTCGTTAAATTATCAAACTTACGTTGAGTGATTAACTTGGCGTTTAGAAGTTGTCTCCA ATAGTTTTTCATCTTTTTGACTACTTCTTCACTTGGAACGTTATCCGATTTACCACGATT TTTATCAGAACGCGTTAAGACCTTATTGTCTATTGAATCGTCTTTAAGGAAACTTTGTGG AACAATGTGATCGACATCATAATCACTTAAACGATTAATATCTAATTCTTGGTCCACATA CATGTCTCTTCCATTTTGGAGATAATAGAGATAGAGCTTTTCATTTTGTAATTGAGTGTT TTCAACAGGATACTCCTTTAGAATATCACTTCCTAGTTCTTTTATTCCTTCTTCAATACG TTTCATACGCTCACGCGAATTTTTCTGGCCCTTTTGAGTTGTCTGATTTTCACGTGCCAT TTCAATAACGATATTTTCTGGCTTATGCCGCCCCATTACTTTGACCAATTCATCAACAAC TTTTACAGTCTGTAAAATACCTTTTTTAATAGCAGGGCTACCAGCTAAATTTGCAATATG TTCATGTAAACTATCGCCTTGTCCAGACACTTGTGCTTTTTGAATATCTTCTTTAAATGT CAAACTATCATCATGGATCAGCTGCATAAAATTGCGATTGGCAAAACCATCTGATTTCAA AAAATCTAATATTGTTTTGCCAGATTGCTTATCCCTAATACCATTAATCAATTTTCGAGA CAAACGTCCCCAACCAGTATAACGGCGACGTTTAAGCTGTTTCATCACCTTATCATCAAA GAGGTGAGCATATGTTTTAAGTCTTTCCTCAATCATCTCCCTATCTTCAAATAAGGTCAA TGTTAAAACAATATCCTCTAAGATATCTTCATTTTCTTCATTATCCAAAAAATCTTTATC TTTAATAATTTTTAGCAAATCATGGTAGGTGCCTAATGAAGCATTAAATCTATCTTCAAC TCCTGAAATTTCAACACTATCAAAACATTCTATTTTTTTGAAATAATCTTCTTTTAATTG CTTAACGGTTACTTTTCGATTTGTTTTGAAGAGTAAATCAACAATGGCTTTCTTCTGTTC ACCTGAAAGAAATGCTGGTTTTCGCATTCCCTCAGTAACATATTTGACCTTTGTCAATTC GTTATAAACCGTAAAATACTCATAAAGCAAACTATGTTTTGGTAGTACTTTTTCATTTGG AAGATTTTTATCAAAGTTTGTCATGCGTTCAATAAATGATTGAGCTGAAGCACCTTTATC GACAACTTCTTCAAAATTCCATGGGGTAATTGTTTCTTCAGACTTCCGAGTCATCCATGC AAAACGACTATTGCCACGCGCCAATGGACCAACATAATAAGGAATTCGAAAAGTCAAGAT TTTTTCAATCTTCTCACGATTGTCTTTTAAAAATGGATAAAAGTCTTCTTGTCTTCTCAA AATAGCATGCAGCTCACCCAAGTGAATTTGATGGGGAATAGAGCCGTTGTCAAAGGTCCG TTGCTTGCGCAGCAAATCTTCACGATTTAGTTTCGCCAATAATTCCTCAGTACCATCCAT TTTTTCTAAAATTGGTTTGATAAATTTATAAAATTCTTCTTGGCTAGCTCCCCCATCAAT ATAACCTGCATATCCGTTTTTTGATTGATCAAAAAAGATTTCTTTATACTTTTCTGGAAG TTGTTGTCGAACTAAAGCTTTTAAAAGAGTCAAGTCTTGATGATGTTCATCGTAGCGCTT AATCATTGAAGCTGATAGGGGAGCCTTAGTTATTTCACTATTTACTCTTAGGATATCTGA AAGTAAAGTAGCATCTGATAAATTCTTAGCTGCCAAAAACAAATCAGCATATTGATCTCC AATTTGCGCCAATAAATTATCTAAATCATCATCGTAAGTATCTTTTGAAAGCTGTAATTT AGCATCTTCTGCCAAATCAAAATTTGATTTAAAATTAGGGGTCAATCCCAATGACAAAGC AATGAGATTCCCAAACAATCCATTTTTCTTCTCACCGGGGAGCTGAGCAATGAGATTTTC TAATCGTCTTGATTTACTCAATCGTGCAGAAAGAATCGCTTTAGCATCTACTCTACTTGC GTTAATAGGGTTTTCTTCAAATAATTGATTGTAGGTTTGTACCAACTGGATAAATAGTTT GTCCACATCACTATTATCAGGATTTAAATCTCCCTCAATCAAAAAATGACCACGAAACTT AATCATATGCGCTAAGGCCAAATAGATTAAGCGCAAATCCGCTTTATCAGTAGAATCTGC CAATTTTTTTCGCAGATGATAGATAGTTGGATATTTCTCATGATAAGCAACTTCATCTAC TATATTTCCAAAAATAGGATGACGTTCATGCTTCTTGTCTTCTTCCACCAAAAAAGACTC TTCAAGTCGATGAAAGAAACTATCATCTACTTTCGCCATCTCATTTGAAAAAATCTCCTG TAGATAACAAATACGATTCTTCCGACGTGTATACCTTCTACGAGCTGTCCGTTTGAGACG AGTCGCTTCCGCTGTCTCTCCACTGTCAAATAAAAGAGCCCCTATAAGATTTTTTTTGAT ACTGTGGCGGTCTGTATTTCCCAGAACCTTGAACTTTTTAGACGGAACCTTATAATCATC AGTGATCACCGCCCATCCGACGCTATTTGTGCCGATATCTAAGCCTATTGAGTATTTCTT ATCCAT ``` 1. Zanima te, kateri protein kodira sekvencirano zaporedje, zato uporabiš orodje [ORFfinder](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/), ki se uporablja za identifikacijo odprtih bralnih okvirov - delov nukleotidnega zaporedja, ki v določenem bralnem okviru ne vsebujejo STOP kodonov. V polje poimenovano "enter query sequence" vstaviš zgornje zaporedje, ostalih nastavitev pa ne spreminjaš in na dnu strani pritisneš "submit". * Koliko odprtih bralnih okvirjev najdeš? * Kateri izmed njih je pravilen in zakaj? * Kateri protein kodira to zaporedje (ime ter UniProt accession code) in iz katerega organizma je? * Kako velik je celoten genom tega organizma? * Kateri ion je potreben za aktivnost tega proteina? * Kakšna je funkcija tega proteina v bakterijskih celicah? 2. CRISPER-Cas sistemi so zaradi nizke cene, ponovljivosti, učinkovitosti in preprostosti med najbolj uporabljenimi pristopi urejanja genomov. * Koliko člankov objavljenih med letoma 2022 in 2024 vsebuje v naslovu besedo *CRISPR* (vključno z navedenima letoma)? * Koliko člankov, katerih besedilo je prosto dostopno, pa vsebuje besedo *cas9*? 3. Iskani protein je večdomenski. Za aktivacijo in opravljanje svoje funkcije mora tvoriti kompleks z gRNA (vodilno RNA). Ta je sestavljena iz dveh RNA molekul: tracrRNA ("trans-activating crRNA") in crRNA, ki omogočata prepoznavo tarčnega zaporedja. Poleg tega pa vsebuje še domene za vezavo tarčne DNA ter nukleazne domene. * Katere izmed domen zgornjega proteina so nukleazne? Zapiši njihova imena ter katere aminokislinske ostanke zajemajo. * Kateri aminokislinski ostanki so v aktivnem mestu nukleaznih domen? * Katera molekula inhibira nukleazno aktivnost? * Katere sekundarne strukture so prisotne v strukturi HNH domene (namig: uporabi [InterPro](https://www.ebi.ac.uk/interpro/))? 4. Poišči iskani protein pri vsaj še desetih drugih organizmih ter s pomočjo poravnave več zaporedij odgovori na spodnja vprašanja: * Zakaj je v poravnavi prisotnih toliko vrzeli in nepodobnih delov? * Katere domene oz. aminokislinski ostanki so najbolj ohranjeni in zakaj? 5. Za pravilno delovanje proteina je ključnega pomena njegova struktura. Ko proučevani protein tvori kompleks z gRNA, pride do konformacijskih sprememb, ki omogočajo njegovo aktivacijo. * Poišči strukturi proteina brez dodanih ligandov ter v kompleksu z vodilno RNA in tarčno DNA. Kakšni sta njuni PDB kodi? * S katero metodo so določili ti dve strukturi? * Kateri ekspresijski sistem so uporabili za določanje strukture proteina? * Kateri del strukture omogoča vezavo RNA molekul?